はじめに
 平成14年度に農林水産省が牛凍結胚の受胎率を調査したところ,体内由来で46%なのに対し,体外由来だと36%という結果になりました。わが国の飼養頭数状況を考慮すると,新鮮胚にあわせて受胚牛を用意することは難しい状況にあると思われます。効率よく移植して産子を増やしていくためには,同期化した受胚牛にあわせた移植が必要であり,胚を長期間保存する技術は不可欠なものであると考えられます。
 現在,移植現場で普及している緩慢凍結法では,性判別胚など胚の一部を切断したり,透明帯を失ったりした体外操作胚についてはうまく細胞内の水分を脱水することができず,残った水分が細胞内で凍結してしまい,胚に重大なダメージを与えてしまいます。また耐凍性が低いと言われている体外受精胚についても,緩慢凍結法では期待していたような胚の生存性や受胎率が得られないのが現状です。そこで,1985年にRallらが開発したのが「ガラス化法」です。この方法では,高濃度のガラス化液で胚を処理することで,急速に細胞内の水分を脱水させることができます。また,仮に脱水しきれなかったわずかな水分が細胞内に残っていたとしても,物理化学的に「凍結」した状態ではないため,胚が受けるダメージは皆無になると考えられています。
 ガラス化法が開発されて以来,原法に改良を加えた方法が多数報告されています。そこで当センターでは,体外操作胚の長期間保存におけるガラス化の効果を,核移植胚および体外受精胚を使って調査しました。

方 法
 基本となるガラス化法ですが,2000年にDinnyesらが報告したSolid Surface Vitrification(以下,SSV法)を採用しました。SSV法は図1のように,極低温に強い,熱伝導率が高い,毒性がないなどの特性をもつアルミニウムの特徴を生かし,アルミホイルでカバーしたメタルキューブを液体窒素で冷却し,その表面に胚を含んだ1〜2μlのガラス化液を落としてガラス化する方法です。今回われわれは,アルミホイルやメタルキューブの変わりに,アルミニウム製のプレートを代用し,「アルミプレートガラス化法」と命名しました。

図1:Solid Surface Vitrification法の模式図
(Dinnyes A,Biol Reprod 63:513-518,2000 FIG.1改)
 この方法の利点としては,大きく3つ考えられます。1つ目は,ドロップを直接液体窒素中に落とすのではなく,冷却されたアルミプレート上に落としますので,ドロップが瞬間的にボイルした際に生じる窒素ガス層が形成されにくく,冷却速度が向上します。またドロップが微量であるため,融解速度も向上します。これらのことは,ガラス化液の毒性や透明帯の損傷から回避するにも有効です。2つ目に,胚の衛生的な取り扱いが可能となります。ドロップをアルミプレート上に落としますので,アルミプレートを消毒でき,また液体窒素中に含まれる細菌や不純物などによる汚染を回避できます。最後に,ガラス化するにあたり特殊な機械を必要としませんので,安価に胚を保存することができます。
 さて実際の方法ですが,まず発泡スチロール内に液体窒素を入れ,消毒したアルミプレートを冷却しておきます(図2)。ガラス化する胚は,平衡液で3分間,ガラス化液で20秒間平衡します。
各メディウムは牛胎児血清を20%加えた199Aが基礎となっており,平衡液には4%エチレングリコールが,ガラス化液には35%エチレングリコール,5%ポリビニールピロリドン,0.4Mトレハロースが含まれています。次にドロップの準備ですが,胚を含んだガラス化液を,先端を細くしたガラスピペットで吸引し,1〜2μlになるようにピペット先端に出します。

図2:アルミプレートの準備
 発泡スチロール内に液体窒素を入れ、アルコールで消毒したアルミプレートおよびクライオチューブを冷却しておく。
 次に,発泡スチロールの縁に手首を勢いよく当て,その衝撃によってドロップをアルミプレート上へ落とします(図3)。落ちたドロップは,ボイルすることなく素早く冷却され,球状を保ってガラス化されます(図4)。最後に,あらかじめ冷却してあるクライオチューブにドロップを入れ,液体窒素中に保存します。融解方法ですが,融解液には0.4Mトレハロースが含まれていますので,2倍階段希釈し,1分間ずつ平衡させます。 融解された胚を確認した後,培養を行います。

図3:アルミプレートへの落下
 発泡スチロールの縁に手首を勢いよく当て,
その衝撃によってドロップをアルミプレートへ落とす。

図4:アルミプレート上に落ちたドロップ
 落ちたドロップは素早く冷却され、球状を保ってガラス化される。
結 果
 最初に,融解後に使用する培養液の違いが,生存性に及ぼす影響を調査しました(表1)。当センターの常法より作出した核移植胚およびと場由来卵子を使用した体外受精胚を,アルミプレートガラス化法によってガラス化した後融解し,18時間培養して形態的に正常と思われるものを「生存」としました。融解後の培養液には,IVD101(機能性ペプチド研究所)および100μM β−ME in 199+5%FBS(以下,β−ME)を使用し,IVD101は5%CO2・5%O2・90%air,β−MEは5%CO2・95%airで培養しました。その結果,核移植胚において培養にIVD101を使用した場合,有意に高い生存率が得られました。また体外受精胚についても,IVD101を使用すると核移植胚と同程度の生存率が得られました。


表1:培養液の違いによる生存率の比較
a,b:χ二乗検定により異符号に有意差あり(P<0.01)

 上述した結果から,IVD101を使用すると生存率が高くなることがわかりましたので,次にIVD101を使用したときの培養時間の違いが生存率に及ぼす影響を調査しました(表2)。培養時間以外の設定は,先ほどと同様です。その結果,いずれも90%以上と高い生存率を示し,有意な差は認められませんでした。



 融解培養後に生存が確認された核移植胚については,同期化した受胚牛に移植して体細胞クローン牛の作出を試みました。その結果,2頭のクローン牛を誕生させることに成功し,現在も順調に発育しています(図5,6)。アルミプレートガラス化法でクローン牛が作出された例は他にはなく,大変貴重な例であり,新聞などの報道機関にも多数取り上げられました。

図5:クローン牛「さくら」(手前)
まとめ
 今回の試験によって,1)微量のガラス化液と,液体窒素で冷却されたアルミプレートを組み合わせる「アルミプレートガラス化法」により,核移植胚および体外受精胚を長期間保存することができる,2)融解後は,IVD101で6時間あるいは18時間培養することで,90%以上の生存率が期待できる,3)クローン牛を作出するにあたり,アルミプレートガラス化法で保存された核移植胚を使用しても影響は認められない,などが明らかになりました。

図6:クローン牛「おりひめ」
 今後は,性判別胚や生体由来卵子を使用した体外受精胚 (OPU−IVF胚)など,様々な種類の体外操作胚をガラス化保存した場合の生存率や受胎率への影響などを調査していきます。また現在の方法では,ガラス化後はクライオチューブに保存する必要があり,融解してガラス化液を除去後,培養して生存している胚を選ぶ必要があるなど,移植までの行程が複雑であることは否めません。そこで,現在現場で普及しているダイレクト移植法のように,移植用ストローに保存し,融解後にそのまま移植できるような簡便化を検討しています。このガラス化法を現場で応用できるようになれば,今まで耐凍性が低い,期待するような受胎率が得られないなどの理由から,ほぼ新鮮胚による移植に限定される傾向にあった様々な種類の体外操作胚を効率的に移植することが可能になり,茨城県における高能力な肉用牛および乳用牛の増産および改良に貢献できると考えています。